• Громилы. Очень опасные единицы противника с мощной бронёй и тяжёлым двуручным оружием (секира, двуручный меч). Атаки громил легко пробивают блок, наносят большой урон и валят Эцио на землю, контратаковать возможно только спаренными скрытыми клинками, захваты блокируются. Пробить защиту этих врагов можно ударив ногой в пах либо использовав дымовую шашку.

• Швейцарские гвардейцы. Самые сложные противники, способные обнаруживать вас в толпе. С тяжёлой броней и одноручным оружием они легко проводят увороты, стреляют из пистолета, блокируют захваты и контратаки. Разоружить так же сложно, как и офицеров. Вне миссий встречаются только в Ватикане, где дежурят возле замка Папы в количестве четырех или пяти человек.

• Стрелки. Делятся на два вида — с арбалетом и ружьём. Опасность стрелков обоих типов в том, что их атаки с дистанции невозможно заблокировать никоим образом кроме ухода в укрытие, и если замеченный игрок не успеет подобраться к врагу до атаки или скрыться и если во время не пригнуться, то после выстрела противника он потеряет часть здоровья.

• Бандиты. Случайные встречи с бандитами не являются редкостью, они смело заявляют о своих намерениях лишить вас кошелька. Когда стража видит бандита она бросается за ним вдогонку, а разделавшись с ним переключаются на игрока.

• Герметисты. Появляются в дополнении «Исчезновение Да Винчи». Такие же как и ловкачи, только в другой одежде.

• Люди Волка (Последователи Ромула). Их легко победить, но они нападают группами. Вооружены кинжалами. Иногда кидают камни или метательные ножи.

Орлиное зрение

Нажатием кнопки головы игрок может активировать спецспособность «Орлиное зрение», меняющую вид камеры. Неинтерактивные объекты в этом режиме сливаются с фоном, темнеют; обычные враги выделяются красным цветом; союзники (воры, наёмники, куртизанки) выделяются синим цветом; укрытия (сады на крышах, стоги сена, скамейки, колодцы) и полезные вещи (перья, сундуки сокровищ, флаги Борджиа) белым цветом; цели задания (жертвы убийства, объекты слежки) жёлтым цветом. Орлиное зрение позволяет провести анализ окружения, моментально оценить текущую тактическую обстановку и составить план дальнейших действий, обнаружить малозаметные объекты.

Многопользовательский режим

Assassin’s Creed: Brotherhood — первая игра серии, в которой реализован многопользовательский режим. Как было показано во время побега из штаба организации «Абстерго» в начале игры Assassin's Creed II, тамплиеры построили специальный объект, содержащий в себе несколько десятков устройств «Анимус». Этот объект служит полигоном для подготовки новобранцев ордена с целью ликвидации Ордена ассасинов. Тамплиеры намерены использовать технику и приспособления своих предков, используя воспоминания самых квалифицированных из тамплиеров.

В многопользовательском режиме будет представлен 21 класс персонажей, из которых: 14 базовых, 4 появляющихся с определенным уровнем, 1 покупной за Uplay очки и 2 доступных в коллекционной и подарочной версиях игры. у каждого из которых имеется своя особая техника убийства и свой комплекс навыков и оружия. В игре присутствуют 8 различных режимов многопользовательской игры: Розыск («Wanted»), Сложный розыск («Advanced Wanted»), Альянс ( «Alliance»), Сложный альянс («Advanced Alliance»), Убийство («Assassination»), Охота («Manhunt»), Эскорт («Escort»), Охота за сундуками («Hunt for chest»). Многопользовательский режим игры осуществляется через игровые сервисы такие как Xbox Live, PlayStation Network.