Для удобства связи между игроками и координирования их действий предусмотрено размещение специальных маркеров в тестовых камерах, которые позволяют обращать внимание партнера на нужный объект, место или призывают совершить какое-то действие. Также персонажам дана возможность делать незначительные для игрового процесса действия — например подавать друг другу знаки жестами рук или пускаться в радостный танец.

Сюжет

Одиночный режим

Долгое время Лаборатория исследования природы порталов пребывала в запустении и о GLaDOS ничего не было слышно. Очнувшуюся Челл встречает один из многочисленных модулей персональности по имени Уитли, который соглашается проводить её к спасательной капсуле. В результате они попадают в комнату управления, где, пытаясь подать питание на спасательную капсулу, Уитли случайно включает GLaDOS. GLaDOS, однако, не спешит мстить Челл; вместо этого она возобновляет испытания с портальной пушкой и одновременно с этим принимается за восстановление разрушенной Лаборатории.

Через некоторое время Уитли удаётся помочь подруге совершить побег. Они решают уничтожить GLaDOS и следуют в цех по производству боевых турелей, где заменяют эталонный образец бракованным (чем провоцируют выпуск только бракованных изделий). Затем друзья уничтожают запасы нейротоксина, чтобы лишить GLaDOS этого оружия. Вскоре Челл и Уитли разделяются, и девушка попадает в ловушку, устроенную GLaDOS. Пытаясь убить беглянку, GLaDOS сначала активирует роботов, но, видя, что они бесполезны, пытается выпустить нейротоксин, но вместо этого появляется Уитли. Это даёт время, и Челл заменяет личностный модуль суперкомпьютера на Уитли при помощи «кнопки принятия решения».

Став почти всесильным, Уитли сначала намеревается отпустить Челл (как и обещал), но затем резко меняет свое мнение, говоря, что она предала его и вообще ничем не помогала. В порыве ярости он ломает лифт, в котором находились Челл и модуль GLaDOS (теперь работающий от картофельной батарейки). Они падают в один из туннелей построеный во время основания лаборатории, однако обеим удаётся выжить.

Беспомощную GLaDOS утаскивает птица, которую ранее случайно привёл в лабораторию Уитли, взяв её яйца, чтобы испортить дверь. Челл вскоре находит её, и GLaDOS уговаривает девушку взять её с собой, мотивируя это тем, что теперь они объединены против общего врага. С этого момента и почти до самого конца игры картофелина с GLaDOS будет помещена на устройство создания порталов.

Вынужденные действовать сообща, они проходят через многочисленные заброшенные помещения, показывающие весь исторический процесс формирования лаборатории от начала 1950-х и заканчивая 1980-ми. Все это время их будет сопровождать записанный на пленку голос основателя лаборатории Кейва Джонсона. Иногда в его беседу будет вклиниваться другой голос — его ассистентки Кэролайн. Постепенно GLaDOS узнает этот голос и «вспоминает», что её основополагающий модуль создан именно на основе Кэролайн, которой стареющий, и больной на тот момент, Джонсон доверил управление лабораторией.

Выбравшись наружу, Челл снова оказывается вовлечена в прохождение тестов, устроенных Уитли. За время их отсутствия Уитли из-за собственной некомпетентности успел как следует разрушить лабораторию, и GLaDOS часто сокрушается по этому поводу. Из-за всех разрушений в лаборатории появилась опасность взрыва реактора.

Пройдя почти все тесты, Челл встречается лицом к лицу с новым хозяином комплекса. Картофелина с GLaDOS помещается в пульт управления, а сама девушка берет на себя открытую борьбу с суперкомпьютером. Уитли решает не повторять ошибок GLaDOS и поэтому удаляет с поля боя все поверхности, на которых возможно открытие порталов. Однако он забывает о трубах, которые взрываются от его же бомб и заливают комнату разноцветными гелями. Поочерёдно добавляя в Уитли бракованные модули, Челл вызывает в нём критическую ошибку, которая даёт возможность произвести обратную замену Уитли на GLaDOS, однако, отброшенная взрывом заминированной «кнопки принятия решения», она теряет возможность окончательно расправиться с врагом. Неожиданно где-то над Уитли обрушивается часть крыши, и становится видна Луна в ночном небе. Вспомнив, что «преобразующий гель» делался из перемолотой лунной породы, героиня из последних сил выстреливает порталом в Луну, и Уитли вместе с Челл затягивает в космос. GLaDOS спасает девушку, заодно отсоединив Уитли. Когда Челл приходит в сознание, перед ней стоят роботы для кооперативных испытаний.