• ГЛэДОС (GLaDOS, Genetic Lifeform and Disk Operating System) — Генетическая форма жизни и дисковая операционная система. Озвучена Эллен Маклейн. В русской версии — Елена Харитонова.

: ГЛэДОС — суперкомпьютер Aperture Science, который при своём запуске обрёл самосознание и убил всех учёных в Лаборатории исследования природы порталов. Взяв управление Лабораторией, ГЛэДОС устроила бесконечный цикл испытаний с Переносным устройством создания порталов на подопытных людях. Когда Челл в игре Portal сумела пройти все испытания, ГЛэДОС пыталась убить девушку, но в результате была сама уничтожена ею. Через некоторое время после пробуждения Челл, Уитли случайно восстанавливает ГЛэДОС.

• Уитли (Wheatley) — модуль персональности. Озвучен Стивеном Мерчантом. В русской версии — Константин Карасик.

: Один из так называемых модулей персональности — шарообразных машин с искусственным интеллектом, для разных целей использующихся в комплексе Aperture Science. Болтливый модуль по имени Уитли был спроектирован для смягчения интеллекта ГЛэДОС, чтобы хоть как-то контролировать её, он перемещается по Лаборатории на специальных рельсах, является проводником и помощником Челл на первых уровнях Portal 2. Позже ГЛэДОС назвала его спроектированным дураком, голосом внутри, опухолью. В конце предаёт Челл и захватывает управление над лабораторией, но ГЛэДОС помешала ему и отправила его в космос.

• Кейв Джо́нсон (Cave Johnson) — основатель и председатель совета директоров корпорации Aperture Science. Озвучен Джонатаном Кимблом Симмонсом. В русской версии — Михаил Георгиу.

Умер до событий Portal. В игре появляется только его голос в виде заранее записанных обращений к испытуемым и несколько портретов разной степени давности.

• Кэролайн (Caroline) — секретарь и правая рука Кэйва Джонсона. Озвучена Эллен Маклейн. В русской версии — Елена Харитонова.

Является прототипом ГЛэДОС. Как и Кэйв Джонсон, в игре появляется в виде голоса и на портрете, который разработчики вставили в качестве пасхального яйца.

• Атла́с и Пи-боди (Atlas and P-body) — два робота, игровые персонажи в кооперативном режиме Portal 2.

: Роботы были собраны ГЛэДОС незадолго до событий Portal как новые подопытные в экспериментах с порталами. Роботы собраны из модуля персональности и автоматической турели. В процессе игры ГЛэДОС также называет их Синий и Оранжевый (Blue and Orange). Атлас мужского пола, а Пи-Боди — женского.

Юмор

Неотъемлемой частью Portal является наличие большого количества юмора в игре; Куб-компаньон и постоянные разговоры ГЛэДОС о торте завоевали симпатию множества игроков и стали популярными Интернет-мемами. В Portal 2 разработчики обещают намного больше подобных вещей, чем в первой части, но они намерены тщательно определиться, какие шутки будут возвращены из Portal. «Я уже сыт по горло шутками про торт», — заявляет главный сценарист игры Эрик Уолпоу, «Кубики останутся, так как они являются одним из игровых элементов, ГЛэДОС останется, но воскрешать мем трёхлетней давности я не хочу. Это будет печально и глупо». Впрочем, и Куб-Компаньон, и торт все-таки промелькнули в игре. Первый (вернее, его копия) был задействован в одной из головоломок, в ходе которой ГЛэДОС неоднократно его дезинтегрировала, а оригинальный Куб был выброшен из комплекса Aperture Science вместе с Челл. Торт был упомянут лишь один раз. После нейтрализации турелей и нейротоксина Челл обнаружила дверь-ловушку, на которой было написано «Аварийное отключение ГЛэДОС и выдача торта» («GLaDOS emergency shutdown and cake dispensary»).